屎肠球菌R2发酵豆腐黄浆水的代谢熏染（一）

黄浆水是屎肠豆腐加工历程中的副产物，富含大豆异黄酮、球菌卵白质以及维生素P、发腐黄K等营养物资，酵豆浆水以及大批水溶性的谢熏糖类，如水苏糖、屎肠棉籽糖、球菌蔗糖等，发腐黄个别被直接排放，酵豆浆水既浪费资源又传染情景。谢熏黄浆水在蕴藏的屎肠历程中可做作发酵为酸浆，是球菌一种精采的豆腐凝聚剂。与石膏、发腐黄卤水作为凝聚剂的酵豆浆水豆腐比照，酸浆豆腐质地详尽、谢熏口感鲜嫩，深受人们喜爱。可是，做作发酵酸浆中含有大批的乳酸菌、酵母及此外微生物，也搜罗一些有害微生物，如蜡样芽孢杆菌，组成酸浆品质不晃动，并对于酸浆豆腐的清静性组成劫持，从而限度了其工业化运用。

由于乳酸菌在酸浆组成历程中起主导熏染，因此纯种乳酸菌发酵制备酸浆成为趋向。当初已经有干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、解淀粉乳杆菌等多种乳酸菌运用于黄浆水发酵中。由于人体不能发生α-半乳糖苷酶，因此黄浆水中的主要低聚糖—水苏糖以及棉籽糖等不能被人体消化运用，在肠道中被细菌发酵产气，导致胃肠胀气。钻研表明有些乳酸菌，如鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌等具备α-半乳糖苷酶活性，在发酵的历程中可运用大豆低聚糖缓解胀气。此外，在乳酸菌发酵黄浆水的历程中，在β-葡萄糖苷酶的熏染下，糖苷方式的大豆异黄酮可能转化为更易罗致的游离型苷元大豆异黄酮，从而普及发酵黄浆水的抗氧化活性。

屎肠球菌（Enterococcusfaecium）属于乳酸菌的一种，是肠道内的个别菌群，普遍存在于传统乳废品、泡菜、豆酱等发酵食物中，具备耐酸、耐热、肠道黏附能耐强等特色，以及抑制病原菌、增强免疫力等熏染。课题组前期从泡菜中筛选出1株屎肠球菌E.faeciumR2，该菌株可运用豆腐黄浆水中的低聚糖妨碍产酸，无需填补碳源以及此外营养素即可抵达豆腐凝聚剂所需的酸度。接管该菌种纯种发酵制备酸浆可实用飞腾大肠杆菌等的传染，既处置了做作发酵酸浆中微生物凌乱的下场，后退了酸浆豆腐的清静性，又可飞腾破费老本，具备普遍的运用远景。为了更好地清晰屎肠球菌R2对于豆腐黄浆水的发酵特色，本钻研接管HPLC法对于屎肠球菌R2发酵豆腐黄浆水历程中的低聚糖、有机酸以及大豆异黄酮的组分以及含量妨碍测定与合成，监控发酵历程中α-半乳糖苷酶以及β-葡萄糖苷酶活性的变更纪律，并对于发酵黄浆水的体外抗氧化活性妨碍评估，揭示屎肠球菌R2的发酵功能特色，以期为屎肠球菌R2的工业化运用提供实际凭证。

1 质料与措施

1.1 质料与试剂

屎肠球菌E.faeciumR2，CGMCCNo.14944（专利珍藏菌种），珍藏于中国微生物菌种珍藏规画委员会艰深微生物中间，由淮南师范学院食品质量与清静试验室提供；食物级黄豆购于淮南苏果超市；黄浆水，试验室重价；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、Ｔrolox、大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素、黄豆黄素、大豆黄素苷、草酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、果糖、葡萄糖、棉籽糖、水苏糖、蔗糖等尺度品，美国Sigma公司；乙睛（色谱纯）、乙酸（色谱纯），天津科密西化化学试剂有限公司；甲醇（色谱纯），永华化学科技（江苏）有限公司；对于硝基苯酚、4-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷、4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷，阿拉丁生化科技股份有限公司；此外试剂均为国产合成纯。MRS液体哺育基：卵白胨10g，酵母浸粉5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵2g，葡萄糖20g，牛肉膏10g，无水乙酸钠5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温-801mL，121℃灭菌15min，冷却备用。黄浆水哺育基：将100mL黄浆水退出到250mL锥形瓶中，密封后121℃灭菌15min，冷却备用。

1.2 仪器与配置装备部署

SW-CＪ-2D型超净使命台，苏州传染配置装备部署有限公司；LRH-250-A生化哺育箱，广东泰宏君迷信仪器股份有限公司；LDZW-60KCS-ll型立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗工具；Ｔ6新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；5804R型离神思，Eppendorf公司；KQ-400B型超声波洗涤机，昆山超声仪器有限公司；HPLC2998高效液相色谱，Waters公司；250妹妹×4.6妹妹5μm氨基柱、250妹妹×4.6妹妹5μmＴhermoC18柱，Aglient公司。

1.3 措施

1.3.1 黄浆水的制备

以传统工艺制作的卤水黄浆水作为低级黄浆水，低级黄浆水接种屎肠球菌发酵剂（接种量3%）发酵36h制患上一代酸浆。以一代酸浆做为凝聚剂制患上二级豆腐黄浆水，再接种屎肠球菌发酵剂（接种量3%）发酵36h制患上二代酸浆。以二代酸浆做凝聚剂制患上三级豆腐黄浆水，如斯循环三代后消除了原卤盐凝聚剂的影响，试验接管三代之后酸浆点制豆腐历程中所发生的黄浆水。

1.3.2 样品制备

将活化后的屎肠球菌R2按3%接种量接入别致豆腐黄浆水哺育基中，于37℃下静置哺育，取患上发酵0，12，24，36h的样品，测定发酵历程中的屎肠球菌R2生物量以及pH的变更趋向。样品经0.45μm微孔滤膜过滤后供后续合成运用。

1.3.3 HPLC测定大豆低聚糖

色谱柱：Aglient氨基柱（250妹妹×4.6妹妹，5μm）；行动相：70%乙腈-30%水（蔗糖、果糖、葡萄糖），68%乙腈-32%水（棉籽糖、水苏糖）；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；柱温：35℃；检测器：示差折光检测器。大豆低聚糖的尺度曲线见表1。

1.3.4 HPLC测定有机酸

色谱柱：AgilentZORBAXSB-Aq（250妹妹×4.6妹妹，5μm）；ＴhermoC18柱（250妹妹×4.6妹妹，5μm）；行动相：10妹妹ol/L磷酸氢二钾（用磷酸调pH为2.55）；流速：0.5mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL。检测器：紫外检测器；波长：210nm。有机酸的尺度曲线见表2。

1.3.5 HPLC测定大豆异黄酮

色谱柱：ＴhermoC18柱（250妹妹×4.6妹妹，5μm）；行动相：A：0.1%乙酸乙腈溶液，B：0.1%乙酸溶液；流速：1.0mL/min，柱温：30℃；进样量：10μL。检测器：紫外检测器；波长：260nm。梯度洗脱条件凭证GB/Ｔ26625-2011。大豆异黄酮尺度曲线见表3。

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